脱蛋白小牛骨应用于牙槽嵴保存技术的研究

　　Ridge preservation with the use of deproteinized bovinebone mineral

　　徐逢源 翻译；庄龙飞 审校

　　关键词：生物材料，拔牙窝，植骨，脱蛋白小牛骨，牙槽嵴

　　摘要

　　目标：本研究旨在检测拔牙窝植入脱蛋白小牛骨矿物经6个月愈合期后的组织构成。

　　材料与方法：本研究纳入25名拟行单颗牙拔除术后行种植修复的患者。牙拔除后，患者被分至实验组和对照组。实验组患者拔牙后于新鲜拔牙窝内植入Bio-Oss® Collagen，对照组不行植骨。经过约6个月的愈合期，于拔牙窝中心取组织样本。样本经脱矿、石蜡包埋、切片及HTX染色，采用形态计量点计数法获得矿化骨、类骨质、骨髓、纤维组织和Bio-Oss®颗粒的百分比。

　　结果：对照组位点(C)的矿化骨占57.4±12.4%，实验组T1位点(不包含植骨材料)的矿化骨占48.9±8.5%。对照组的骨髓(C: 7.1±6.1%, T1: 2.1±3.1%)以及类骨质(C: 7.3±4.9%, T1: 1.9±2.1%)的量比实验组约大五倍。纤维组织构成分别占23.1±16.3% (C)和40.0±11.9% (T1)。 T2位点(包含植骨材料)，矿化骨的比例为39.9±8.6%，骨髓和类骨质的比例分别为1.8±2.5% 和 1.6±1.8%。 T2位点的纤维组织和Bio-Oss®颗粒各占32.4±9.2%和19.0±6.5%。

　　结论：新鲜拔牙窝内植入生物材料将延迟拔牙窝的愈合。 Bio-Oss®颗粒不发生吸收，而被新生骨包绕。这或能解释植骨的拔牙位点不产生尺寸改变的原因。

　　多颗牙缺失将导致牙槽嵴的萎缩 (e.g., Tallgren1957, 1966; Atwood1962, 1963; Johnson1963, 1969;Carlsson et al. 1967; Pietrokovski &Massler 1967; Schropp et al.2003)。单牙拔除后亦将造成牙槽嵴颊-舌/腭向大量萎缩(Schropp et al.2003)，且拔牙窝颊侧比舌/腭侧骨壁萎缩量更大(Pietrokovski &Massler 1967)。

　　为维持拔牙后牙槽嵴的尺寸，学者尝试在新鲜拔牙窝内植骨(自体骨或同种异体骨)和骨替代材料(异体合成植骨材料，异种骨)(e.g.Beckeret al. 1994, 1996; Gross 1995;Artzi et al. 2000)。Nevins et al. (2006)研究了9位患者36个上前牙区拔牙窝颊侧骨壁改变的结果。 17个拔牙窝未行植骨， 19个拔牙窝内植入异种骨，应用CT跟踪最长至3个月。结论表明植入异种骨移植物的拔牙窝“ 19个位点中有15个位点颊侧骨壁丧失<20%。与之对比， 17个对照位点中有12个(71%)颊侧骨壁丧失量大于20%。”

　　犬 动 物 实 验(Arajoet al. 2008,2010; Araujo &Lindhe 2009,2009)证实，牙槽窝内植入脱蛋白小牛骨材料(i)推迟了愈合，但(ii)保存了缺牙牙槽嵴的尺寸。

　　本研究旨在检测人拔牙窝内植入Bio-Oss® collagen的实验组与不行植骨的对照组经过6个月愈合期后的组织构成。

　　材料与方法

　　本研究遵循赫尔辛基宣言的伦理准则，并经意大利Perugia大学人类审查委员会通过。

　　本研究纳入25个拟拔除上颌或下颌单牙后种植修复的患者个体。患者年龄范围为25至54岁，无系统性疾病，无影响骨代谢药物的服药史。排除已有重度骨吸收的患牙(X线显示骨高度位于釉牙骨质界下≥4mm)和/或颊侧骨存在裂隙型缺损≥2mm(牙拔除术后确定)。每位患者提供一个牙(拔牙)位点。牙拔除术采用牙周膜分离器(periotome)和牙挺行无翻瓣拔除患牙。若拔牙窝符合纳入标准，患者则被分配至实验组或对照组。

　　实验组拔牙后，于拔牙窝内植入Bio-Oss® Collagen(Geistlich Pharma, Wolhusen, Switzerland)，并覆盖胶原膜(Mucograft®; Geistlich Pharma)，Mucograft®用颊舌/腭向十字交叉缝合固定。对照组拔牙后，拔牙窝内仅由血块充填，创口与实验组相同覆盖Mucograft®膜。

　　愈合期6个月后，从拔牙窝处获取组织样本。在种植窝洞预备过程中，应用内径为3mm的空心环钻取长度为5-6mm(“冠-根向” )的硬组织块。随后继续制备种植窝，植入1颗种植体(直径3.5,4.0或4.5mm; AstraTech® System, Mölndal, Sweden)，安装愈合螺丝。间断缝合复位软组织瓣。埋入式愈合3个月后，连接基台并开始修复。

　　组织学样本制备与测量

　　采用4%缓冲甲醛溶液保存硬组织样本，经EDTA脱钙、酒精脱水后石蜡包埋。硬组织切片的制取与骨块长轴平行获得一系列切片，并包含骨块的中心部分。切片厚度设定为5μm。应用苏木精和伊红染色标本(HTX)。此外，应用兔单克隆抗体CD34 (Abcam pic,Cambridge, UK)显示血管结构。

　　组织学分析应用配备影像系统(Q-500 MC®; Leica)的Leitz® DM-RBE显微镜(Leica, Wetzlar, Germany)。

　　组织形态学分析测定应用Schroeder& Münzel-Pedrazzoli (1973)描述的计量点计数方法。在组织切片上覆盖含100个或400个光点的栅格，确定矿化骨(板层骨和编织骨)，类骨质(部分矿化的富胶原的结缔组织基质)，骨髓(脂肪细胞和血管结构)，纤维组织(疏松的胶原纤维，细胞和血管)， Bio-Oss®颗粒，和余留组织(未能识别的组织成分，组织制备过程产物)的所占比例。

　　拔牙后植骨位点的成分分析分为2个阶段进行。第1阶段中生物材料未纳入测量(T1位点)，第2阶段所有成分(包括Bio-Oss®颗粒)均纳入测量(T2位点)。

　　应用未配对t检验比较实验组和对照组的组织学特征。

　　结果

　　实验组纳入了2个切牙， 9个前磨牙，以及2个磨牙位点 ；下颌4个位点，上颌10个位点。对照组的活检样本取自8个前磨牙和3个磨牙位点 ；下颌7个位点，上颌4个位点。

　　拔牙后牙槽窝顺利愈合。经过6个月的愈合期后，所有实验组和对照组的位点均被健康角化牙槽嵴黏膜覆盖。

　　组织学观察

　　未植骨位点
　　大多数未行植骨的拔牙位点的硬组织柱边缘部分为一层不同厚度的致密骨皮质(图1)。中心/根尖部分的组织构成为板层骨和骨髓的混合物(图2)，编织骨的量各不相同，但在大多数位点仅少量存在。板层骨形成于样本的外侧部分，在样本更中心的部位亦存在硬组织突起和条索，被骨髓环绕。骨髓包含脂肪细胞，间充质细胞，白细胞和血管结构(图2)。

　　植骨位点

　　骨矿化层(“皮质帽” )仅存在于实验组11个位点中的5个(图3)。硬组织样本的外侧壁和外侧部分由板层骨和编织骨的混合物构成，在更靠近中心的部分可观察到许多Bio-Oss®颗粒被富含间充质细胞、纤维和血管结构的结缔组织包裹。在样本的所有部分中，异种骨移植物颗粒的大小差异很大。在大多数Bio-Oss®颗粒的表面(并非全部)，可见少量新生骨长入纤维结缔组织(图4)。但是一些Bio-Oss®颗粒位于含有“成纤维细胞样”细胞和白细胞混合物的结缔组织中，与新生骨的发生无关联。

　　组织形态学测定结果

　　第1阶段测量

　　矿化骨(包含板层骨和编织骨)构成对照位点被检组织的57.4±12.4%(表1)。 T1位点(不包含植骨材料)相对应的值为48.9±8.5%(P< 0.05)。对照组的骨髓(对照组: 7.1±6.1%, T1: 2.1±3.1%; P< 0.01)以及类骨质的(对照组: 7.3 ±4.9%, T1: 1.9 ±2.1%)约较实验组大5倍(P <0.01)。纤维组织在对照组占23.1±16.3%，在T1位点占40.0±11.9%(P< 0.01)。

　　实验组和对照组新生组织中的血管结构的含量(表2)相似(实验组T1: 2.8±1.8%, 对照组: 3.3±1.7%; 图5)。

　　第2阶段测量

　　该阶段测量分析包含了实验组植骨生物材料所占的比例(表1)。 T2位点矿化骨(板层骨，编织骨)占比为39.9±8.6%，骨髓和类骨质占比分别为1.8±2.5%(骨髓)和1.6±1.8%(类骨质)。 T2位点纤维组织占比32.4±9.2%，Bio-Oss®颗粒占比19.0±6.5%(表1)。

　　讨论

　　本研究证明经过6个月愈合期后，非植骨位点与拔牙后植入Bio-Oss® Collagen的牙槽窝愈合有显著的差异。在未植骨的拔牙位点，皮质帽形成于拔牙窝的边缘部分，板层骨/编织骨及骨髓充填了中央及根尖的部位。不同的是，在植入Bio-Oss® Collagen的位点，未观察到明显的皮质帽形成，中央及根尖的部位存在的生物材料颗粒被中间结缔组织包绕。大多数Bio-Oss®颗粒表面有不等量新生骨形成。

　　拔牙窝愈合

　　本研究的组织学样本取自拔牙/牙根后6个月。新生组织包括约60%矿化骨(板层骨和编织骨)， 7%骨髓以及约25%富血管结缔组织构成。最近的一项研究描述了无牙颌上下颌不同部位的组织构成(Lindhe et al.2013)。 Lindheet al. (2013)纳入位点的缺牙时间范围为>6个月至数年。与本研究的组织样本相比，此项研究的位点缺牙时间更长，两者的矿化骨含量相类似，但在本研究的位点中骨髓含量高出2-3倍，结缔组织含量较少(1/3)。一系列犬动物模型研究已描述拔牙窝的组织重建过程。未成熟骨组织及中间结缔组织将被骨髓和板层骨替代(Cardaropoliet al. 2003)。由于本研究中未植骨的对照组样本骨髓含量较少，中间结缔组织含量较多，因此大多数拔牙位点经6个月的愈合期其组织新生(组织改建和重建)并未完成。

　　皮质帽

　　本研究发现多数未植骨位点的边缘区域存在由板层骨构成的皮质帽，与之前的研究结果一致。 Cardaropoli et al. (2003)和Araujo & Lindhe (2005)利用犬动物模型研究拔牙窝的愈合过程，观察到2个月时拔牙窝边缘形成了硬组织桥分隔拔牙窝与边缘粘膜， 2个月时此硬组织桥由编织骨构成，后期加强形成板层骨(6个月)。本研究中，大多数实验位点的组织样本中未观察到清晰的不间断的硬组织桥。本研究中皮质帽形成的延期结果与犬模型研究(Araujo et al. 2008; Arajo & Lindhe2009)的结果不同。他们认为新鲜拔牙窝内植入BioOss® Collagen确实促进了“嵴顶区域硬组织形成”，但是同时，研究者亦发现该新生硬组织桥的构成包含大量被编织骨包裹的生物材料颗粒。犬动物模型研究的上述结论与本研究的结论之间的差异让人费解，这或许可以归因为物种差异和/或拔牙窝内生物材料的植入充盈程度不同。 Araujo &Lindhe(2009)的研究中首先在拔牙窝内充填Bio-Oss® Collagen，但同时在“颊侧骨壁的边缘部分”亦覆盖生物材料。本研究的实验组拔牙窝内先植入Bio-Oss® Collagen，牙槽骨入口区覆盖胶原膜(Mucograft®)促进软组织愈合。换言之，在多数实验位点， Bio-Oss®材料未超出拔牙窝的范围。

　　延期愈合

　　本研究中，对照组拔牙位点中的皮质骨和骨髓构成高于实验组。这表明拔牙窝内植骨明显延迟了硬组织的愈合，这与之前的研究结果一致(e.g. Wetzel etal.1995; Diès et al. 1996; Carmagnola et al.2003; Araujoet al. 2008)，并再一次证明拔牙窝内植入生物材料将推迟组织重建和改建。

　　在植骨位点，生物材料位于样本中心，并被富含细胞、纤维和血管的结缔组织包围。样本的侧方部分则常可观察到新形成的矿化骨“壁”。这表明植入BioOss® Collagen后，拔牙窝的侧壁和植骨材料之间形成了血凝块，骨组织重建在此血凝块部位启动， 6个月时已形成新的硬组织。 Araujoet al.(2010)利用犬模型研究拔牙创与Bio-Oss®整合的动态过程，其结果与本研究的结果一致。他们的研究提出拔牙窝植骨后的愈合“在根尖以及侧方区域相比中心及边缘区域更快”。

　　Bio-Oss®颗粒被中间结缔组织包绕，在多数异种骨物颗粒的表面可观察到少量新生骨。有理由推测随着愈合时间的延长参与新骨形成的Bio-Oss®数量会增加。该推测已被Hallman et al.(2001)的研究证实，他们将自体骨和异种骨移植物的混合物植入30个患者的上颌窦腔内。他们观察到6个月后获取的组织样本中板层骨占20%， 3年后板层骨占51%，未成熟骨所占比例极小：<1%(Lindgren et al.2012)。

　　余留植骨材料

　　本研究的植骨位点中Bio-Oss®颗粒约占活检样本的20%，该数字与Norton et al.(2003)报道的一项人类研究结果相似。他们将Bio-Oss®颗粒植入拔牙窝或“牙槽骨缺损处”，经平均6个月的愈合期后获取骨组织样本。他们发现新生骨占26.9%，剩余植骨材料占25.6%。本研究的数据亦与Araujo et al. (2010)的结论一致，他们指出犬拔牙窝内植入Bio-Oss® Collagen后在4周的观察期内小牛骨矿物的量维持稳定(第1、 3日和第1、 2、 4周)。这表明拔牙窝内的小牛骨矿物或不被吸收，基本维持不变。 Hallman et al(2001)以及Lindgrenet al.(2012)的发现进一步证实了该假说，他们分析了人类上颌窦植骨后的组织样本， Hallman et al. (2001)报道了植骨位点生物材料的占比6个月时为14.5%， 3年时为12.4%。 Lindgrenet al.(2012)发现3年后Bio-Oss®颗粒的面积占比为24±13.5%。换言之， Bio-Oss®颗粒似能“抗吸收”。