不翻瓣牙槽嵴位点保存术中是否移植异种骨对颊侧骨嵴改建的影响的组织形态学定量分析和显微CT成像研究

　　The effect of a flapless alveolar ridgepreservation procedure with or without a xenograft on buccal bone crestremodeling compared byhistomorphometric and microcomputed tomographic analysis

　　黄卓砾 翻译；王刃 审校

　　关键词 ： 动物模型，成骨，牙槽窝，植骨

　　摘要

　　目的 ： 本研究通过比较组织形态定量分析和显微CT成像数据评估不翻瓣拔牙术中是否植骨对颊侧骨嵴改建、牙槽窝愈合后的成分及牙槽嵴形态保存的影响。

　　材料与方法 ： 8只狗的下颌前磨牙在不翻瓣的方法下拔除。同一侧下颌骨的一个牙槽窝植入骨移植材料（试验组），另一个仅保留血凝块（对照组）。术后12周，比较分析颊侧骨嵴、牙槽嵴形态与成分的组织形态学和显微CT结果。

　　结果 ： 2维和3维研究显示植骨组的结果优于非植骨组。

　　结论 ： 组织形态定量分析和显微CT成像观察显示，相比仅有血凝块愈合的牙槽窝，不翻瓣方法下植入去蛋白小牛骨材料行牙槽嵴位点保存术能更有效地保存颊侧骨嵴、牙槽骨的形态和促进新骨形成。

　　采用动物模型研究牙槽嵴位点保存术可以提供血凝块形成和成熟、临时基质的形成和最终骨形成这一系列骨愈合过程中的重要信息。评估牙槽窝愈合后的成分(骨髓形成组织和残留植骨材料颗粒的百分比)、牙槽嵴形态(水平向和垂直向)以及近来倍受关注的颊侧牙槽嵴顶水平对研究某种方法能否消除或减少拔牙后骨吸收的负面影响非常有效(Horvath et al. 2013)。

　　众所周知，牙槽骨是一种牙齿依赖的解剖结构，在恒牙拔除后会发生大量的形态变化(Cardaropoli etal. 2003; Farmer & Darby 2014)。一项系统性综述(Tan et al. 2012)报道人类拔除牙齿6个月后水平向骨吸收达29-63%，垂直向骨吸收达11-22%。牙槽窝的骨丧失或吸收通常在颊侧表现更为显著，因为颊侧骨板密度高，骨髓数量少，加之颊侧骨板更薄，更易碎，使其比腭侧或舌侧骨板更易吸收(Novaes et al.2011)。

　　术中不翻瓣是减少牙槽窝改建的一种技术(Fickl et al. 2008a,b)。拔牙过程中将带走牙周膜并使粘骨膜瓣分离，这将影响双侧的血供。当颊侧骨壁较薄时，冠方区域通常为皮质骨，血管少，将导致大量骨吸收。

　　不同类型的去蛋白小牛骨矿物质(松质骨、皮质骨或两种混合物)，结合或不结合引导组织再生术，是牙槽嵴位点保存术中最常用的生物材料之一(Artziet al. 2004; Jensenet al. 2006; Araujo et al. 2008, 2010;Araujo &Lindhe 2009)。在一些研究中，牙槽窝内植骨效果良好 ；而其他一些研究则对这种技术的效果提出质疑。

　　到目前为止，定量的组织学技术仍是评估骨小梁和皮质骨结构的标准。尽管组织学分析是唯一能获得骨改建过程中细胞结构和动态指标信息的方法，但它在评估骨微观结构方面仍有局限性，因为结构参数需要一些2D层面的体视学分析得来。

　　显微CT (micro-CT)近年来被用于评估离体样本的骨量和形态，它具有许多优势 ： (1)它可以直接3D测量骨小梁的形态 ； (2)与2D组织学分析相比，它能进行更大量的数据分析 ； (3)未脱钙骨样本的测量比组织形态学分析更快 ； (4)测量没有损伤性，因此样本还可以继续用于其他研究，例如组织学或机械性能试验(Bouxsein et al. 2010)。

　　本研究的目的是通过比较组织形态学结果和显微CT影像，评价不翻瓣拔牙术中是否植入去蛋白小牛骨矿物质对颊侧骨嵴顶改建、牙槽窝愈合后的组成及牙槽嵴形态保存的影响。

　　材料与方法

　　试验设计

　　本试验经动物试验伦理委员会批准后进行研究(项目号 ： 2013.1.777.58.1)。试验共用了8只比格犬，约3岁大，平均重15 kg。选择小型犬的目的是保证所有样本的颊侧骨板都是薄型。所有动物的下颌骨均正常，没有合创伤，没有病毒或真菌性口腔病损，一般状况良好，经兽医检查没有系统性疾病。首先，所有狗都进行疫苗注射，抗寄生虫治疗，并用超声洁治头(Cavitron 3000, Dentisply York, PA, USA)进行牙周洁治去除牙石和菌斑。

　　手术过程

　　菌斑控制2周后，由一位经验丰富的医生进行所有手术过程。

　　所有动物在手术前一天晚上开始禁食。手术过程中，狗预先用乙酰丙嗪麻醉(0.2% ； 0.1 mg/kg)，再用Zoletil 50 (tilemina+zolazepan 0.12ml/kg， Virbac, SaoPaulo, Sao Paulo, Brazil)麻醉。由挥发性麻醉药物维持麻醉，因此动物们都用Magill探针进行气管插管术以适应麻醉设备和管理氧气稀释的挥发性异氟烷(2% v/v; Isothane, Baxter Hospitalar, São Paulo, São Paulo, Brazil)。此外，还进行局部麻醉，双侧4颗下颌双尖牙(图1a)用不翻瓣的方式拔除。牙齿由颊舌向切开，小心的拔除牙根，避免损伤牙槽骨壁(图1b)。牙齿拔除后，用千分尺测量颊侧骨壁厚度和牙槽嵴尺寸(水平向和垂直向)。选择双侧下颌第二双尖牙(P2)的近中根牙槽窝和第四双尖牙(P4)的远中根牙槽窝进行试验(图1c)。这个过程同时也是另一个研究的一部分，剩余的牙槽窝用于即刻种植研究。由于两个试验都是对试验位点中间部分的颊舌向截面进行研究，所以一只狗进行两个试验对本试验模型并没有影响。在一侧下颌骨中随机选择一个牙槽窝，将异体骨(去蛋白小牛骨矿物， MinerOss X; BioHorizons, Birmingham, AL, USA)填满整个牙槽窝(试验组)，另一个牙槽窝仅允许形成血块填满空虚的牙槽窝(对照组)(图1d，e)。根据随机交叉定位法，对侧下颌骨中试验位点的处理则与之相反(Papalexiouet al. 2006)。试验中不使用膜。随后，双侧下颌的创口都用4-0可吸收缝线缝合(图1f)。采用悬吊缝合或八字缝合封闭边缘，帮助血块固定或使植骨材料固定在牙槽窝中。

　　术后注射盐酸曲马多(50 mg/ml; Tramal®, UniãoQuímica Farmacêutica Nacional, Pouso Alegre, MinasGerais, Brazil)进行镇痛治疗，按3 mg/kg剂量每隔12 h注射一次共3天 ；注射美洛昔康(2 mg/20 kg; Maxicam,OuroFinoSaude Animal, Cravinhos, Sao Paulo, Brazil)共5天进行抗炎治疗。所有动物还注射螺旋霉素(750,000IU/10 kg)和甲硝唑(125 mg/10 kg) (Stomorgyl 10, MerialSaude Animal, Paulınia, Sao Paulo, Brazil)共10天进行抗生素治疗。 7天后拆线。所有动物进软食15天，每周用牙刷、牙线和局部使用0.12%洗必泰控制菌斑黏附。余留牙每月用超声器械清洁。术后12周，所有动物在深度麻醉下注射过量的硫喷妥钠和氯化钾进行安乐死。切除下颌骨、解剖、切开，并用10%盐酸缓冲的福尔马林(pH 7)固定。样本先进行显微CT分析。之后，样本放入100%酒精中脱水，浸润，并嵌入LR白色树脂中(London Resin Company, Berkshire, UK)，用Donath和Breuner (Donath & Breuner 1982)描述的技术进行硬组织切片。每个牙槽骨样本的中心位点部分选取颊舌向截面切片。将切片的厚度打磨抛光减小至约25 µm。切片用茄红素染色，用于光学显微镜分析其组织形态学。

　　显微CT分析

　　样本用台式显微CT扫描仪(SkyScan 1172 micro-CT, SkyScan N.V., Kontich, Belgium)扫描。扫描使用100 kV和100 µA，用铝-铜滤光器调节至较佳对比度，并设定为9.92 mm像素大小、 180旋转，平均4帧， 0.40旋转步距。使用重建软件(NRecon v.1.4.4, SkyScan N.V.)创建图像。二维图像分析使用DataViewer软件。将图像沿长轴位置摆放，测量其颊侧骨嵴宽度、牙槽嵴高度及宽度数值。

　　用CTAn软件(CTAn., v. 1.8.1.2, SkyScan N.V.)进行三维分析。首先，选择感兴趣区域(Region of interest，ROI)，定在牙槽窝的中心位置，以牙槽嵴冠方最高点为顶边的一个宽2mm、长3mm的长方形。横截面内的所有ROI的连续集合用来决定感兴趣区域的体积(Volume of interest， VOI)，代表选择区域的3D体积。灰度值二值化定义密度50-100为骨组织， 100-255为生物材料。在这些设定完成后，分析以下参数 ： ROI骨体积总量、 ROI骨体积总量的百分比、骨表面密度、骨小梁数量，骨小梁厚度和骨小梁间隔。

　　组织形态学分析

　　每个牙槽窝的颊舌向切面的组织学结果用装备在Leica DM LB2显微镜上的Leica DFC310FX数码相机(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)分析。用LAS v. 4.1软件进行图像分析，测量者不知道试验分组。

　　颊侧牙槽嵴顶水平(Buccal bone crest level, BCL)定义为舌侧牙槽嵴顶到颊侧牙槽嵴顶的垂直距离(图2)。

　　牙槽嵴宽度(Alveolar ridge width, ARW)定义为牙槽嵴最高点下方1 mm处颊侧和舌侧骨壁外侧面之间的假想水平连线的长度测量(图2)。

　　面积测量仅在牙槽窝中心以牙槽嵴最高点为顶边的宽2 mm、长3 mm的长方形区域内进行(图3)。骨面积测量评估矿化骨百分比和骨髓区域百分比的比值。同时还评估结缔组织(Connective tissue， CT)、骨的总面积(Total bone area， TBA)和残留植骨颗粒(Residualgraft particles， RGP)百分比。

　　统计分析

　　所有参数都计算其均值、中位数值和标准差。使用Wilcoxon配对非参数测验进行组间比较。使用95%可信区间。用GraphPadInstat (GrapPad Software, Inc.,La Jolla, CA, USA)统计软件进行分析。

　　结果

　　临床结果

　　整个愈合过程顺利，试验过程没有并发症。

　　临床分析

　　两组牙槽嵴宽度值和颊侧骨壁宽度值在基线时没有差异。

　　组织学分析

　　总体而言，实验样本和对照样本中都观察到原板层状骨(Parent lamellar bone area， PLBA)即“旧骨”(Oldbone， OB)，及以区域交错排列的纤维结构的平行纤维状骨(Paralle-fbered bone， PFB)即编织状骨(Wovenbone)为特征的新成骨区域(Newly formed bone area，NFB)(图4和5)。在一些区域中还观察到类骨质基质(Osteoid matrix， OM)，他们排列在成骨细胞周围，代表骨形成和骨改建过程(图4)。在试验组的牙槽窝中还观察到残留植骨材料颗粒(Residual graft particles，RGP)(图4)。

　　新骨从拔牙位点的根方和侧壁延伸生长至中间部位，两组的牙槽窝中心都观察到新骨存在，但试验组的更多(图6)。这个结构(NFB)和原板层状骨(OB)的界限清晰(图4、 5)。另外，两组的冠方都有新骨形成，关闭了牙槽窝的入口(图6)。试验组的残留植骨材料颗粒分散在中间区域，周围有新骨形成，并与其直接接触；在一些样本中，还很难分辨两者之间的界限(图4)。许多迹象显示去蛋白小牛骨材料被骨组织所替代，包括破骨细胞活跃在残留植骨材料颗粒的周围(图7)。

　　组织形态学定量分析结果

　　总而言之，所有组间差异均具有显著的统计学差异，植骨组效果更好(表2、 3)。

　　试验组的颊侧牙槽嵴顶水平显著优于对照组，具有统计相关性。试验组的颊侧牙槽嵴顶水平位于舌侧嵴顶根方0.09 ± 0.29 mm，对照组位于舌侧嵴顶根方0.51± 0.48 mm(表2)。

　　试验组的牙槽嵴宽度为5.08 ± 0.05 mm，对照组为3.88 ± 0.93 mm，具有显著的统计学差异(P=0.0023)(表2) 。

　　所有区域的结构(100%)分为结缔组织、骨组织区域和残留植骨材料颗粒。试验组中，结构由19.70 ±10.91%结缔组织、 73.51 ± 5.28%骨组织和6.73 ± 5.35%残留植骨材料颗粒 ；而对照组的结构则由54.15 ±10.81%结缔组织和45.84 ± 10.81%骨组织组成。两组间结缔组织和骨组织区域的百分比值均具有显著统计学差异(P=0.0001)(表3)。

　　试验组中残留植骨材料颗粒(RGP)的百分比为6.73%，显示部分生物材料被吸收，部分仍残留的牙槽窝中帮助新骨形成(表3)。

　　显微CT结果

　　采用显微CT图像研究3D骨微结构主要检查以下三个基本的形态学指标 ：骨体积(Bone volume， BV)、观测区域的总体积(total volume of interest， TV)和骨表面(Bone surface， BS)。根据这些测量值，测量的变量可以定义为 ：骨体积(BV) ：识别为骨区域的体积，单位为mm3 ；骨体积分数(BV/TV):识别为骨区域的体积与ROI的总体积的比值，以百分比表示 ；骨表面密度(BS/TV)，骨表面与测量区域骨总体积的比值(1/mm)。在本试验中，植骨组的所有三维参数结果都大于非植骨组，其中两个数据的组间比较结果具有显著统计学差异(表4)。不同的是，评估骨小梁微结构的重要参数骨小梁数量(测量每单位骨小梁的平均数量)、骨小梁的厚度(骨小梁的平均厚度)和骨小梁间隔(骨小梁之间的平均距离)发现，两组间都没有统计学差异(表4)。

　　2D测量结果显示植骨组的颊侧骨嵴宽度、牙槽嵴宽度和高度都显著优于对照组(表5)。

　　比较每组代表性的显微CT图像(图8、 9)显示两组在治疗后3个月的颊侧骨壁结构有差异。植骨组能更好的保存颊侧骨壁。

  

　　讨论

　　本研究显示去蛋白小牛骨作为植骨材料能有效减少拔牙对牙槽骨组织的负面影响。

　　牙槽窝骨壁会显著减少，且颊侧骨板的改变明显大于舌侧骨板(Araujo &Lindhe 2005; Pietrokovski et al.2007)。

　　本组织形态学研究显示植骨组的颊侧牙槽嵴顶水平高度显著优于非植骨组。然而，最近两项狗的动物实验研究(Bashara et al. 2012 and Maia et al. 2015)却显示植入其他去蛋白小牛骨植骨材料相比对照组并没能更好的保存颊侧牙槽嵴顶水平。 Araujo等(Araujo et al.2008)发现颊舌侧牙槽嵴顶水平之间的垂直距离在非植骨的位点为2.1 ± 0.5 mm，而植入Bio-Oss Collagen的位点为1.9 ± 0.6 mm。这个结果比本试验结果(非植骨 组0.51 ± 0.48 mm和MinerOss X植 骨 材 料 组0.09 ±0.29 mm)明显增大，这可能与其试验中翻瓣操作相关。Fickl等同样在一项动物研究发现不翻瓣操作对牙槽窝骨改建有明显的益处(Fickl et al. 2008a,b)。该作者报道，不翻瓣组的吸收率明显减少。在本研究中，试验组的颊侧骨壁吸收率比对照组减少25%，显示不翻瓣下在牙槽窝内植入MinerOss X有助于颊侧骨壁的改建。

　　许多系统性综述显示牙槽窝位点保存术可能减少拔牙后骨量的改变，尽管牙槽骨宽度和高度的仍然会 减 少(Ten Heggeler et al. 2011; Horvath et al. 2013)。尤其在人体研究(Norton et al. 2003; Cardaropoli et al.2012)和动物研究(Araujo et al. 2008)中都显示去蛋白小牛骨作为植骨材料能成功保存牙槽嵴的形态。

　　本组织形态学和显微CT数据同样显示试验组的牙槽嵴形态明显得到保存。例如，植骨位点的牙槽嵴颊舌向的减少量比非植骨组降低21%。这个结果对于后期的种植治疗具有很大影响，尤其在美学区域。

　　关于组织构成方面，不同研究显示试验组和对照组的组织改建基于相同的模式。 Maia等(Maia et al.2015)的一项狗模型研究显示植骨位点和非植骨位点的组织构成平均为50%结缔组织和50%骨组织区域。作者提出植骨组和非植骨组的矿化组织的量相同，显示在牙槽窝愈合的3个月中，去蛋白小牛骨材料不能增强愈合或促进硬组织形成，仅作为组织形成的支架结构。

　　Araujo等(Araujo et al. 2008)在狗的新鲜牙槽窝中植入Bio-Oss collagen,发现3个月后非植骨位点的组织成分比植骨位点愈合更成熟，植骨位点残留植骨材料颗粒为12%。这个结果显示尽管在骨缺损区植入生物材料可能促进硬组织形成和减少缺损，但实际上植骨材料可能延迟愈合。同一个团队(Araujo &Lindhe 2009)还评估了在牙槽窝内植入Bio-Oss collagen6个月后的愈合情况，却发现两组组织成分相同，没有统计学差异。并且植骨材料颗粒并没有主动吸收。这个结果与Bashara等(Bashara et al. 2012)在狗的新鲜牙槽窝内植入同种植骨材料6个月后的形态学结果相同。

　　实际上，许多作者提出去蛋白小牛骨颗粒植入骨缺损部位并没有吸收，而是成为持续存在于骨组织周围的惰性外来物(Traini et al. 2007, 2008; Iezzi etal. 2008)。另一方面，其他报道称在几个月的愈合期后，颗粒周围有破骨细胞活跃，推测经过一段时间颗粒会发生改建，形成新骨。然而，这个过程较为缓慢(Bashara et al. 2012)。

　　如今已经肯定去蛋白小牛骨材料具有良好的骨引导性能，加之其吸收缓慢，这是它的一大优势(Jensen&Sindet-Petersen 1991; Traini et al. 2007)。

　　本研究的组织形态学分析显示，植骨材料颗粒周围通常能观察到破骨细胞和成骨细胞形成新骨，代表骨改建过程活跃。而且，在许多样本中，植骨材料颗粒和形成的新骨之间的界限很难定义，这表示植骨材料颗粒被高度整合。与之前的研究不同，在本研究测量组织成分，植骨位点和不植骨位点的骨总区域(73.51×45.84%)和结缔组织区域(19.70×54.15%)有显著差异。 3个月后， MinerOss X残留植骨材料颗粒的百分比为6%，低于Araujo等(Araujo et al. 2008)植入Bio-Osscollagen观察同样长时间的试验所报道的12%。

　　近年来，通过高分辨率显微CT成像评估动物和人体样本的骨小梁和皮质骨形态被广泛应用。尽管组织学分析是唯一能提供骨改建的细胞和动态指数信息的方法，但它在评估骨微观形态的应用中仍有不足，因为成分参数只能通过一些二维截面的体视学分析获得。相比较而言，高分辨率三维成像技术，例如显微CT，能直接测量骨微观结构。本研究所计算的形态学指标，包括骨总体积，骨总体积的百分比和骨表面密度，是量化描述骨结构的标准方法，因此试验组所示的更优秀的结果表示植骨位点形成的骨量更多。与预期相同，这些结果与组织形态定量分析结果一致，证明MinerOss X在牙槽嵴保存过程中有效。不同的是，根据以下三维参数测量骨小梁微观结构 ：骨小梁数量、骨小梁厚度和骨小梁间距，在两个试验组间并没有显著的统计学差异，表示形成的新骨质量在两组间没有差异。

　　二维显微CT结果也与组织形态定量分析研究结果相同。颊侧骨壁宽度与牙槽嵴宽度和高度的形态学研究显示使用去蛋白小牛骨材料在牙槽嵴位点保存术中具有显著作用。

　　结论

　　组织形态定量分析和显微CT分析表明，不翻瓣的牙槽嵴位点保存术植入去蛋白小牛骨材料与仅有血块愈合的牙槽窝相比能减少颊侧骨壁的丧失，更好的保存牙槽嵴的形态，促进新骨形成。

　　致谢

　　作者要感谢国家科学技术发展委员会(CNPq)对Barros医师的奖学金支持(项目号162546/2013-0)和圣保罗区研究基金对本研究的经济支持(项目号2013/24324-0)，以及BioHorizons(Birminghan， AL， USA)对本研究捐赠的植骨材料。