采用双相磷酸钙携载大肠杆菌产rhBMP-2和无机牛骨进行上颌窦骨移植的前瞻随机对照试验

　　Prospective randomized, controlled trial of sinus grafting using Escherichiacoli-produced rhBMP-2 with a biphasic calcium phosphate carrier compared to deproteinized bovine bone

　　张晓梦 翻译；赖红昌 审校

　　关键词：骨替代材料，临床研究，临床试验，生长因子，上颌窦提升术

　　摘要

　　目的：本研究主要对比双相磷酸钙(BCP)携载大肠杆菌产的重组人骨形态发生蛋白-2(ErhBMP-2)和无机牛骨在人上颌窦提升术中发挥的作用。

　　材料与方法：本试验经过筛查以及受试者知情同意后共选出56个位点，其中46个被纳入，最终完成试验的41个。通过随机数表把这些位点分为两组，采用两种不同的材料进行上颌窦提升术。 24周后使用环形骨钻进行手术备洞和活检，并植入比活检位点稍粗的种植体。上颌窦提升术后即刻和术后24周行计算机断层扫描和全景平片检查。重建放射影像以测量线性和体积的变化。活检样本经过处理后行组织学和组织测量学分析。

　　结果：所有位点最终均顺利愈合，无并发症发生。影像学分析结果显示，手术后骨量有所增加，但任一组均无显著统计学差异。两组间的骨量变化差异也无统计学意义。而且，尽管组织学分析发现愈合过程不同，但是两组的各组织学测量参数之间并无差异。

　　结论与临床意义：本研究结果提示，与传统无机牛骨材料相比，采用BCP携载ErhBMP-2不能更明显地增加上颌窦提升术24周后的骨再生。

　　自被Boyne & James (1980)引进以来，上颌窦提升术就成为牙槽骨严重吸收或者发生上颌窦气化的上颌后牙区的一种修复方式(Wallace & Froum 2003)。之前的许多临床研究已证明，上颌窦提升术可获得成功的骨再生并且种植体具有与在原生牙槽骨中植入的植体相似的成功率(Browaeys et al. 2007; Pjetursson et al. 2008; Esposito et al. 2009;Nkenke & Stelzle 2009)。 Mordenfeld (2010)等运用无机牛骨材料进行上颌窦提升术，术后11年的组织活检可见再生的成熟骨组织和未吸收的牛骨材料。

　　上颌窦提升术可采用各种各样的骨移植材料，如自体骨、同种异体骨、异种骨、合成材料或者这些材料的混合物等。自体骨和同种异体骨可能会因供体的病变、数量不足和受体部位长期愈合后的过度骨吸收等因素而具有局限性(Clavero & Lundgren 2003; Andersson 2008)。因此，许多临床医生更偏于使用起到支架作用的合成材料，如羟基磷灰石(HA)、双相磷酸钙(BCP)或无机牛骨(Lindgren et al. 2012; Oliveira et al. 2012; Schmitt et al. 2013)。 由于上颌窦是一个由骨生发源、骨性窦底窦壁和上颌窦黏膜(施耐德膜)所围绕的空腔，因此上颌窦提升术中即使是使用骨引导材料而非骨诱导材料也能获得成功的骨再生和良好的临床效果。然而，在一些上颌窦底牙槽骨严重缺损的病例，临床骨再生所需的愈合时间就会更长，直至再生骨量能够进行种植体植入术(Nkenke & Stelzle 2009)。

　　为了减少骨再生的愈合时间，基础和临床研究领域的多种骨增量技术中均使用到了重组人骨形态发生蛋白(rhBMP-2)。 rhBMP-2是从中国哺乳动物仓鼠卵巢细胞中提取的一种蛋白质，基于多项临床研究，美国食品和药物管理局已经通过了对它的认证(Boyne et al.1997, 2005; Triplett et al. 2009)。而且，最近的临床前体内外研究均证明，通过大肠杆菌表达系统产生的rhBMP-2 (ErhBMP-2)具有和哺乳动物细胞来源的rhBMPs同样的生物学效应。 Lee (Lee et al. 2010)等研究发现，当采取可吸收的胶原海绵(ACS)作为载体负载ErhBMP-2运用于大鼠颅骨缺损模型时，与对照组相比，不同的剂量的ErhBMP-2均能诱导更优异的骨再生。 Jung (2011)等采用可吸收的胶原块负载ErhBMP-2运用于大鼠颅骨缺损的骨再生，进一步证实了ErhBMP-2的骨诱导活性。

　　由于BCP的骨传导性和携带生长因子的能力，采用BCP作为支架材料携载ErhBMP-2，ErhBMP-2明显增加了上颌窦膜的骨诱导性能，这在之前研究中得到证明(Choi et al. 2013)。 BCP携带的ErhBMP-2在大鼠的颅骨缺损修复中也发挥了优异的作用。还有研究证明，负载ErhBMP-2的块状冷冻干燥BCP明显增加了新骨形成(Kim et al. 2011)。多项临床前研究，包括动物实验也证实了BCP携载ErhBMP-2 (ErhBMP-2/BCP)的骨诱导活性，但是，目前有关其运用于上颌窦骨移植的临床研究非常少。因而，本研究主要采用计算机断层扫描(CT)和组织学分析技术，选取传统植骨材料无机牛骨作为对照，比较ErhBMP-2/BCP和无机牛骨在上颌窦提升术中的效果。

　　材料与方法

　　本研究为单盲随机对照临床试验，主要在两个医学中心(韩国延世大学牙科医院和仁荷大学医院)进行。研究方案已通过延世大学口腔医院的临床研究组织审查委员会的审核(通过号码2-2011-0006)，并遵从赫尔辛基宣言(2004年东京修订版)和临床实践指南。所有参加临床研究的患者均要签署书面知情同意书，知情同意书参照CONSORT指南制作(附录S1)。

　　样本量

　　样本量由G power软件计算得出(Version 3; Faul et al. 2009)。零假设为ErhBMP-2/BCP相比无机牛骨能够更明显促进上颌窦提升术后的骨再生。两组新骨区域的组织学测量指标相差10%被认为有差异，α水平设为0.1。结果的标准差设为10%，同之前保持一致(Cordaro et al. 2008)。每组所需的样本量为18，鉴于假设的10%退出率，每组就需要20个患者进行注册。本研究共有52个患者志愿参加，其中符合纳入标准的46个患者最终决定参加试验。每个医学中心的最初患者数根据参与研究的手术医生数目决定 ：医学中心A的44个和医学中心B的12个(图1)。

　　图1.　随机化分配处理流程图

　　随机化

　　随机组分配采用区组随机化(SAS, SAS Institute,Cary, NC, USA)。计算机随机产生的数字由第三方放入一个非透明的信封。上颌窦黏膜被提升后，才打开信封，并由助手把相应数字对照的材料拿给手术医生。参与研究的患者并不知道所使用的为何种材料。

　　ErhBMP-2/BCP颗粒的制备

　　本研究采用大肠杆菌表达系统来制备ErhBMP-2，主要在Cowellmedi公司的研究机构(釜山，韩国)进行。微孔BCP(颗粒状，直径0.5-1.0 mm，孔隙率70% ；Bio-C, Cowellmedi)由混合比例为30:70的羟基磷灰石和β-磷酸钙组成，用作ErhBMP-2的载体。本研究采用之前描述过的冷冻干燥法把ErhBMP-2负载到BCP上(Kim et al. 2011)。简单来说，就是把ErhBMP-2溶液(0.67ml，1.5 mg/ml)加入1克的BCP 颗粒中,然后在冷冻干燥机中进行处理。把此溶液置于预冷到-43℃的架子上进行冷冻。再将此放入-40℃的冷凝机中进行干燥(初步干燥)，维持此温度3小时，然后转入5 mm汞柱的压力舱2小时。第二次干燥按照以下的温度顺序：-20℃内4小时，-10℃内4小时，0℃内2小时和20℃内20小时。冻干过程中的压力要保持不变。

　　时间点和手术步骤

　　临床试验前，所有的研究者均要参加一个校准会议，主要是由经验丰富的高年资医生(K.S.C.)向所有参与试验的术者介绍手术过程的所有步骤。所有的受试者均要在术前1小时和术后7天服用抗生素(500 mg阿莫西林和150 mg罗红霉素)和止痛药(200 mg布洛芬)。采用特殊设计的外提升器械盒(LAS-KIT, Osstem, Seoul,Korea)和膜抬高器械盒(DASK, Dentium, Seoul, Korea)由外侧入路行上颌窦提升术。局麻下，在患者的手术位点行牙槽嵴切口及近中纵切口。翻开全层黏骨膜瓣，暴露牙槽嵴和上颌窦外侧壁。采用特殊设计的钻头进行标准的骨开窗术，打开骨圆窗(直径7毫米)后小心地对上颌窦黏膜进行提升。确定上颌窦粘膜的连续性后，根据随机组分配原则，在此提升的空间填入移植材料—对照组的无机牛骨(Bio-Oss, Geistlich Biomaterials,Wolhuser, Switzerland)和预制的ErhBMP-2/BCP(Cowell BMP, Cowellmedi, Busan, Korea)。植入材料后，再次使用Valsalva方法确定上颌窦黏膜没有发生穿孔。最后使用4-0葡糖酸盐可吸收单股线(Monosyn, B-Braun,Aesculap, Center Valley, PA, USA)进行黏骨膜瓣的缝合，术后10~18天拆线。为了获得初始参数，上颌窦提升术后立即行影像学检查。上颌窦提升术后24周进行种植手术，术前行影像学检查来评估骨移植位点。翻开黏骨膜瓣后，使用内径3毫米的环形骨钻沿着种植体植入部位的长轴取得骨移植区域的活检样本。每个骨移植的上颌窦选择一个组织活检部位。按照常规的手术方案，选择直径比备洞活检部位稍大的种植体植入洞中。在骨质量较差的情况下，使用特殊的手术方法，如使用小一号的终钻和上颌窦内提升方法来达到初期稳定性。

　　影像学分析

　　本研究使用各种影像图像来分析上颌窦骨结构的病变、密度、高度和宽度。所有的CT片均采用DICOM格式，包括上颌窦区域在内的完整图像使用3D重建软件(OnDemand3D, Cyber-Med, Seoul, Korea)进行分析。CT断层图像和全景平片用来获得以下的线性测量参数 ：骨移植区域的最高点和最低点(CT和全景片) ；两点之间的距离使用计算机程序进行测量。沿着冠向、矢状向和轴向对骨移植区域的3D重建图像进行多边形切割和颜色编码来进行体积变化的测量。图像处理后，移植材料的体积可用计算机程序自动测出(图2)。影像学测量由两个研究者(M.S.K. and H.K.S.)各自独立完成。

　　图2.　将术后即刻CT和术后24周CT重叠后的影像学分析。术后即刻(a)和术后24周 (b)骨增量区域的3D重建影像(红色箭头所指)，CT图像可以参照不变的结构如颧弓、鼻中隔等来做重叠。重建影像叠加后，重叠组合图像(d)显示术后即刻(c)和术后24周(e)的上颌窦尺寸变化。彩色加强图像：24周观察期的样本，虚线 ：术后即刻提升区域的顶部。

　　组织学分析

　　上颌窦提升术后，试验者小心地从钻头分离出在活检部位取得的环形骨块，然后用5%甲酸脱钙14天再用石蜡包埋。围绕着每个环形骨样品的中心取得一系列冠状面切片。选择最靠近中心的两个切片，进行苏木精、曙红(HE)染色和马松三色染色。光镜(BX50,Olympus, Tokyo, Japan)下观察这些组织学切片并进行定量分析。

　　组织测量学分析

　　组织测量学分析主要由两个独立的研究者(M.S.K.and H.K.S.)使用自动图片分析系统(Image-Pro Plus, Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)来进行骨再生的定量分析。他们主要评估以下参数 ：剩余的移植材料区域(RG)、新形成骨的区域(NB)和非矿化区域(NM)。非矿化区域主要是指既非RG又非NM的剩余区域。

　　统计学分析

　　研究者需计算出对照组和试验组在影像学图像和组织切片上测得的所有参数的均值、标准差和中值。Shapiro–Wilk检验被用来检测所有数据是否正态分布，除了体积分析的一个结果外，所有在CT图像上测得的数据均显示为正态分布。非配对t检验来检测正态分布的数据，Mann–Whitney U检验来检测非正态分布的数据，从而分别观察两个时间点之间和两组之间是否有显著的统计学差异(P=0.05)。研究者之间影像学和组织测量学参数测量的可靠性主要由组内相关系数(ICC)进行量化。影像学分析和组织测量学分析的ICC分别为0.869和0.966，置信水平均为95%，这说明两个研究者的测量分析结果具有很高的可靠性。

　　结果

　　患者信息

　　共56个志愿者(中心A的44个和中心B的12个)在2011年7月和2012年10月间申请参与本临床试验。 10个志愿者在筛选和纳入过程中被除去：6个在术前放弃并退出，4个在膜提升过程中严重损伤了上颌窦黏膜而不能够继续进行上颌窦提升植骨术。因此，共46个位点参与纳入本次临床研究，并被随机分为两组 ：对照组(n=23)和试验组(n=23)，其中34个在中心A进行，12个在中心B进行。在这46个位点中，有5个是纳入后被排除的，分别是由于上颌窦黏膜在材料填压的过程中发生穿孔(n=1)、不可控的血糖水平(n=1)、违背研究时间要求(n=1)、放弃协议中途退出(n=2)。因此，临床试验最终在41个位点完成(22男和19女，平均年龄为52.37±12.03岁，均值±标准差)，主要进行了上颌窦提升植骨术和种植体植入术。其中31个位点是在中心A完成(对照组和试验组分别为16个和15个)，10个在中心B完成(对照组和试验组分别为5个) ； (表1和图1)。

　　表1.　受试患者群的人口学描述和上颌窦描述(均值±标准差【中值】)

　　临床结果

　　所有位点均平稳愈合，无上颌窦提升失败包括术后感染等重大并发症发生。然而，临床发现有一些受试者会发生小的并发症，包括术后肿胀、疼痛和出血(对照组和试验组分别为7个和1个)、上颌窦黏膜的穿孔(所有病例中均小于3 mm的穿孔)(对照组4个和试验组3个)、由纵隔分隔为两个窦腔的上颌窦需要准备两个骨开窗(对照组1个和试验组1个)、种植体植入时较差的骨质量(对照组0个和试验组2个)、术后接近骨开窗的部位向口腔漏出移植材料(对照组0个和试验组1个)。在上颌窦黏膜小穿孔的病例中，术者需先在穿孔部位使用胶原膜(Bio-Gide, Geistlich Biomaterials,Wolhuser,Switzerland)覆盖后再行材料移植。 24周后在种植体植入术前，骨移植的位点仍然保持稳定，除了试验组的一个受试者的种植体骨结合失败，所有植入的种植体均获得了初期稳定性。植入种植体并行最终修复后的平均随访时间分别为中心A的94.83天和中心B的203.67天，所有种植体的累计存留率为98.63%。

　　影像学结果

　　在受试的41个位点中，影像学图像上出现移植材料的非正常扩散和24周后移植部位的尺寸比例变化超过200%均被认为是上颌窦黏膜丧失了连续性或发生了穿孔，这些情况均要排除在研究分析之外(n=4)。上颌窦提升术后，全景片上试验组移植区域的高度立即提高到13.41±4.27 mm，对照组提高到13.86±3.59mm ； 24周后两组的高度分别改变为13.66±4.75 mm 和14.17±4.19 mm。在断层CT图像上，移植区域的初始高度分别为试验组12.55±3.27 mm和对照组13.11±2.03mm ；上颌窦提升术24周后高，两组的高度分别为13.29±3.44 mm和13.84±2.14 mm。体积测定分析使用两种不同的方法以减少测量误差：(1)依靠放射不透性使用计算机软件来界定提升的区域，然后把体积直接换算为数据，(2)使用上颌窦内的空气体积来计算两个时间点之间的差异。 CT图像并不能完全显示整个上颌窦(尤其是上部)，因此把同一患者的两个时间点的图像进行重叠来决定参考点。界定的上颌窦区域主要由放射透光区(空气)和放射不透光区(移植材料)组成，提升体积的变化由空气体积的变化计算得出(图2)。影像学分析显示，两组的线性参数和体积均有微小的增长趋势，但是每组的两个时间点之间没有显著的统计学差异。两组之间的体积变化差异也无统计学意义(图3和图4)。

　　图3.　上颌窦提升术后即刻和术后24周试验位点和对照位点的具有代表性的影像学图像。 (a)术后即刻的对照位点，(b)术后24周的对照位点，(c)术后即刻的试验位点，(d)术后24周的试验位点。

　　图4.　影像学测量上颌窦提升术后即刻和术后24周两时间点之间的高度和体积变化结果。全景片(a)和CT(b)上测量的高度变化，CT图像测量计算的体积变化(c)。浅灰色代表对照组，深灰色代表试验组。

　　组织学结果

　　组织学分析可发现两组之间的愈合方式稍有差异。在试验组，BCP的表面呈现了不规则的形态，可能是由于移植材料的表面吸收所致。 RG和NB之间可见脂肪髓样组织，尤其是在试验组。相反，对照组的RG即使是在术后24周也维持了原始的形态(图5和6)。

　　图5.　组织测量学分析中目的区域的组织切片代表的低倍镜观。目的区域的下边界为移植材料的最下部，上边界为环钻所取活检组织的最高部位。 (a)对照组，(b)试验组(H-E染色 ； ×40)

　　图6.　组织切片代表的高倍镜观。 (a)试验组的组织学结果：移植的材料颗粒被不成熟的骨组织即新骨(NB)包围，非矿化组织主要由脂肪髓样组织(FM)和富脂肪组织样区域组成。 (b)试验组内紧靠移植材料的多核巨细胞(方框内)，可能为破骨细胞。 (c)对照组的组织学结果 ：富含活细胞的NB分散在移植材料中，材料的原始形态为细胞缺乏的骨组织区。 (HE染色 ； ×100)。

　　组织测量学结果

　　在所有组织学切片中，选取从窦底到标本最高点的中央部位作为目标区域。排除组织切片缺少原始骨组织的标本3例，不作组织测量分析，3例都来自于试验组。对照组的总面积为10.27±5.56 mm²，实验组为7.67±11.07 mm²。在两组中根据RG区的特异形态而将其区别。对照组的移植材料与NB的组织学表现相近，但是其具有特征性的锐利边缘、骨小梁模式和无活细胞的骨陷窝。两组的移植材料都被纤维结缔组织和NB包绕。 NM主要包含纤维结缔组织、髓样脂肪组织和血管组织。对照组的NB面积为2.02±1.11 mm²，试验组为1.85±8.08 mm²。两组对应的RG面积分别为1.79±1.24mm²和1.45±1.21 mm²；NM分别为6.45±3.80 mm²和4.39±6.23 mm²。两组间所有参数间的比较未发现显著统计学差异(表2、图7)。

　　图7.　目标区域的组织测量学分析结果(NB，新骨 ； RG，剩余材料 ；NM，非矿化区)。

　　表2.　影像学测量和组织测量学分析的结果(均值±标准差【中值】)

　　提升的高度(mm)在2D(全景片)和3D(重建的CT图像)上测量，提升的体积(mm3)在3D上测量

    为了评估上颌窦黏膜的小穿孔可否作为混杂因子，根据上颌窦黏膜是否发生穿孔把对照组和试验组的所有样本分为两个亚类，结果见表3。尽管影像学或组织学分析结果显示新形成骨在各亚类之间并无差异，但是组织测量学显示试验组中发生小穿孔的亚类的新骨形成的面积(0.41 ±0.19 mm²)明显少于其它亚类(试验组非穿孔亚类和对照组的穿孔/非穿孔亚类分别为2.14±4.44，3.39±1.17和2.05 ±1.13 mm²)。

　　表3.　根据上颌窦提升术中黏膜是否发生穿孔所分亚类的影像学和组织测量学分析的结果(均值±标准差【中值】)

　　提升的高度(mm)在2D(全景片)和3D(重建的CT图像)上测量，而提升的体积(mm3)在3D上测量

　　穿孔 ：对照组和试验组在上颌窦提升术中发生了黏膜小穿孔的亚类

　　非穿孔 ：对照组和试验组在上颌窦提升术中没有发生黏膜小穿孔的亚类

　　讨论

　　本研究设计了一个两中心合作的前瞻性随机单盲临床试验，借助影像学和组织学分析，定量对比传统骨移植材料和ErhBMP-2作为移植材料的上颌窦提升效果。基于之前的许多临床前研究和动物模型实验已证明rhBMP-2能够加速骨愈合和异位成骨，作者假设ErhBMP-2能够更明显地促进上颌窦提升后的骨再生。然而，本研究的结果没有显示ErhBMP-2相比传统的骨传导材料作为上颌窦提升术的移植材料具有任何优势。

　　在影像学分析中，研究主要评估了术后即刻和术后24周两个时间点之间的骨移植区域的尺寸变化，试验组和对照组显示了相近的体积和线性变化趋势 ；提升区域的体积和高度均稍有增加，而两组之间并无显著的统计学差异。然而，采用ErhBMP-2/BCP的试验位点24周的高度和体积变化范围更广，其高度和体积的最大值均更高。这些结果与之前的研究结果保持一致，即在兔子的上颌窦提升模型中，ErhBMP-2/BCP相比只用BCP在早期的愈合过程中显示了更明显的体积提升(Choi et al. 2013)。此研究还发现在后期体积提升有所减少，但是总体来说体积仍稍有增加。有研究证明，ErhBMP-2在早期愈合过程中会增加术后组织肿胀(Smucker et al. 2006; Leknes et al. 2008; Shah et al. 2008)，这可能会影响体积的变化。然而，本研究中两组的所有样品均在临床显示出足以植入种植体的骨量，而且这个体积并没有发生明显变化。

　　本研究中所有样本的组织学和组织测量学分析均显示，活检位点形成了新骨。由于这些样本都是从牙种植体植入的位点获得，组织学分析只能局限于从牙槽嵴顶算起的10 mm，无论这些骨是原有的牙槽骨还是提升的牙槽骨高度。对照组和试验组的骨密度和剩余生物材料比例基本相近。之前的一个临床前研究，采用与本研究相同的生物材料进行兔子的上颌窦提升骨移植，在术后8周发现了相似的骨愈合过程。

　　在进行为期2周的观察时，Choi等(2013)发现在ErhBMP-2处理的试验位点发生特异的愈合模式，而无ErhBMP-2的对照位点却没有。即新形成的骨都集中在上颌窦黏膜周围，提升的上颌窦中央却仅观察到有限的骨组织。虽然本研究的临床观察期更长(24周)，这种愈合方式可能会影响植骨区的上颌窦中央的骨密度，从而妨碍组织活检样本的获取。所以，尽管两组环形钴钻取骨的程序完全一样，试验组的活检样本体积还是比对照组小(对照位点和试验位点的样本大小分别为10.27±5.56 mm²和7.69±11.07 mm²)。有趣的是，具有上颌窦黏膜小穿孔的试验组位点在组织样本上呈现出有限的新骨形成，而在对照组发生小穿孔的位点却和其他位点新骨形成的量相似。这可能是缘于之前的动物实验所论证的愈合机制，即ErhBMP-2能够增加上颌窦黏膜的骨诱导活性(Choi et al. 2013)。这些结果也与之前的一个临床研究结果保持一致，研究发现rhBMP-2对上颌窦提升的骨再生和骨密度具有负性的效应(Kao et al. 2012)。然而，本研究的临床指标、组织学和影像学参数均提示，试验组具有和对照组相近的结果。除了试验组的1枚种植体没有获得初期稳定性，所有获得的组织样本均呈现了紧挨剩余移植材料的成功骨再生。因此，就像无机牛骨，ErhBMP-2/BCP可以作为上颌窦提升术的骨移植材料。

　　本研究在评估单独ErhBMP-2的效应上具有一定的局限性。如若评估ErhBMP-2在加速上颌窦提升骨愈合过程中的作用，备洞活检和植入术的时间点需要设在临床疗效发生前，从而能够对比骨愈合的早期过程。然而，本研究由于一些伦理问题设计保守，进而可能影响对照组和试验组的对比。而且，两组的支架材料也不同，对照组采用作为传统移植材料标准的无机牛骨，试验组采用BCP，这是因为韩国的国家法律仅允许BCP作为ErhBMP-2的载体材料。因此，本研究的结果相比之前运用相同材料的临床前研究，结果也更为保守，这也就意味着进一步的研究需要使用更多观察时期和支架材料。

　　在以上所述的局限范围内，本研究可以得出以下结论 ：从临床、影像学和组织学各方面参数来看，BCP携载ErhBMP-2作为上颌窦提升术的骨移植材料，与传统的无机牛骨相比，在术后24周并未显示更明显的骨再生效应。

　　致谢

　　本研究获得韩国健康福利部的韩国健康技术研发项目(no. A110266)资助。